【试剂】

【操作步骤】

1.样本前处理及核酸提取  

样本前处理：

取适量皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结，于灭菌研钵充分研磨，用PBS按照1：3体积稀释成均匀乳剂，经10 000rpm离心3 min。

核酸提取：

(1)取200μL上述样本离心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL离心管,然后加入200μL裂解液，剧烈振荡。(蛋白酶K开盖使用后建议存于2-8℃)混匀5～10秒。

(2)56℃温浴10分钟。

(3)在上述离心管中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀5～10秒。

(4)将步骤3中混匀的液体转移至一只套有收集管的纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，弃去套管内液体。

(5)将500μL去蛋白漂洗液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。

(6)将700μL洗涤液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。

(7)可选：重复步骤（6）。

(8)再将纯化柱放回接液管上，13 000rpm离心1分钟。

(9)将纯化柱移到一只干净的1.5mL离心管中。

(10)向离心柱内加50μL洗脱液，室温静置1分钟后12 000rpm离心1分钟，弃纯化柱，离心管内液体中含有基因组DNA。提纯的基因组DNA如果不立即使用，请保存于-20℃。

2. 荧光PCR加样体系（总体系20 μL）：将下列试剂加入PCR反应管中。

（注：阴、阳性对照设立，由试剂盒提供的阳性对照、灭菌水直接替换“模板”即可。）

3. 反应程序

在荧光PCR仪上进行以下反应：95 ℃ 180s，循环95 ℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共45次, 每次循环的第三步（72℃ 20 s）收集荧光信号（报告基团“HEX”，淬灭基团“BHQ1”）。

【结果判定】

1 阈值设定

检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 

2 质控标准

(1) 阴性对照：无Ct值无扩增曲线。

(2) 阳性对照：Ct值≤30.0，并出现典型的扩增曲线。若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。

3 结果描述及判定

阴性  被检样品无Ct值且无明显扩增曲线，判为山羊痘病毒核酸阴性；

阳性  检测样品Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时，判为山羊痘病毒核酸阳性；

可疑  对于Ct值＞42.0的样品且出现典型的扩增曲线或者Ct值≤42.0但无典型的扩增曲线时，应重检，重检Ct值≤42.0且出现典型的扩增曲线时判为阳性，其他情况均判为阴性。

【注意事项】

1.B盒使用之前请完全溶解并离心数秒后使用，蛋白酶K开盖使用后建议保存于2-8℃。

2 反复冻融试剂将降低检测灵敏度，尽量减少反复冻融。

3 为避免样本间的交叉污染，模板最后加，加模板时先加阴性对照，再加检测样品，最后加阳性对照，有条件的实验室加模板的移液器应与加其它组份的移液器分开。

4 上机前注意检查确保反应混合液内无气泡，且反应管盖紧，以免荧光物质泄漏区污染仪器。

【生产企业】   

企业名称：山东绿都生物科技有限公司

生产地址：山东省滨州市经济开发区黄河二路169号绿都生物工程高科技园

电    话：18266598399       

【有效期】本制品有效期为1年，生产日期见包装内侧。