【试剂】

【操作步骤】

1.样本前处理及核酸提取  

样本前处理：

取适量病料心、肝、肠等组织，于灭菌研钵充分研磨，用PBS按照1：3体积稀释成均匀乳剂，经10 000rpm离心3 min。

核酸提取：

(1)取200μL上述样本离心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL离心管,然后加入200μL裂解液，剧烈振荡。(蛋白酶K开盖使用后建议存于2-8℃)混匀5～10秒。

(2)56℃温浴10分钟。

(3)在上述离心管中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀5～10秒。

(4)将步骤3中混匀的液体转移至一只套有收集管的纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，弃去套管内液体。

(5)将500μL去蛋白漂洗液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。

(6)将700μL洗涤液加入纯化柱上，10 000rpm离心1分钟，并弃去套管内液体。

(7)可选：重复步骤（6）。

(8)再将纯化柱放回接液管上，13 000rpm离心1分钟。

(9)将纯化柱移到一只干净的1.5mL离心管中。

(10)向离心柱内加50μL洗脱液，室温静置1分钟后12 000rpm离心1分钟，弃纯化柱，离心管内液体中含有基因组DNA。提纯的基因组DNA如果不立即使用，请保存于-20℃。

2. PCR加样体系（总体系20 μL）：将下列试剂加入PCR反应管中。

（注：阴、阳性对照设立，由试剂盒提供的标准品直接替换“模板”即可。）

3. 反应程序

4. 电 泳

配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5uL，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加3μl DL2000 DNA Marker，在120v-130v 电压下，1×TAE液中电泳15-20min，在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】

    在372b左右位置出现扩增带，核酸检测为阳性（如图）。

    在372b左右位置未出现扩增带，核酸检测为阴性 。                         

【注意事项】

1.B盒使用之前请完全溶解并离心数秒后使用，蛋白酶K开盖使用后建议保存于2-8℃。

2 反复冻融试剂将降低检测灵敏度，尽量减少反复冻融。

3 为避免样本间的交叉污染，模板最后加，加模板时先加阴性对照，再加检测样品，最后加阳性对照，有条件的实验室加模板的移液器应与加其它组份的移液器分开。

4 上机前注意检查确保反应混合液内无气泡，且反应管盖紧。

【生产企业】   

企业名称：山东绿都生物科技有限公司

生产地址：山东省滨州市经济开发区黄河二路169号绿都生物工程高科技园

电    话：18266598399

【有效期】本制品有效期为1年，生产日期见包装内侧。