【试剂】
编号 |
20T |
50T |
保存 |
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裂解液 |
4mL |
10mL |
室温 |
A盒 |
无水乙醇 |
4mL |
10mL |
室温 |
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去蛋白漂洗液 |
12mL |
28mL |
室温 |
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洗涤液 |
32mL |
77mL |
室温 |
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洗脱液 |
2mL |
5mL |
室温 |
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蛋白酶K |
0.2mL |
0.5mL |
-20℃ |
B盒 |
PCR反应液 |
200μL |
500μL |
-20℃ |
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引物 |
40μL |
100μL |
-20℃ |
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阳性对照 |
30μL |
30μL |
-20℃ |
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阴性对照 |
300μL |
300μL |
-20℃ |
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DL2000 DNA Marker |
20μL |
50μL |
-20℃ |
【操作步骤】
1.样本前处理及核酸提取
样本前处理:
取适量病料心、肝、肠等组织,于灭菌研钵充分研磨,用PBS按照1:3体积稀释成均匀乳剂,经10 000rpm离心3 min。
核酸提取:
(1)取200μL上述样本离心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL离心管,然后加入200μL裂解液,剧烈振荡。(蛋白酶K开盖使用后建议存于2-8℃)混匀5~10秒。
(2)56℃温浴10分钟。
(3)在上述离心管中加入200μL无水乙醇,充分振荡混匀5~10秒。
(4)将步骤3中混匀的液体转移至一只套有收集管的纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,弃去套管内液体。
(5)将500μL去蛋白漂洗液加入纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,并弃去套管内液体。
(6)将700μL洗涤液加入纯化柱上,10 000rpm离心1分钟,并弃去套管内液体。
(7)可选:重复步骤(6)。
(8)再将纯化柱放回接液管上,13 000rpm离心1分钟。
(9)将纯化柱移到一只干净的1.5mL离心管中。
(10)向离心柱内加50μL洗脱液,室温静置1分钟后12 000rpm离心1分钟,弃纯化柱,离心管内液体中含有基因组DNA。提纯的基因组DNA如果不立即使用,请保存于-20℃。
2. PCR加样体系(总体系20 μL):将下列试剂加入PCR反应管中。
PCR反应液 引物 |
10μL 2.0μL |
模 板 |
8μL |
(注:阴、阳性对照设立,由试剂盒提供的标准品直接替换“模板”即可。)
3. 反应程序
94℃预变性 |
5min |
94℃变性 |
30s |
51℃退火 |
30s 共34个循环 |
72℃延伸 |
30s |
72℃延伸 6min |
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4℃ |
5min |
4. 电 泳
配制1%琼脂糖凝胶,取PCR产物5uL,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3μl DL2000 DNA Marker,在120v-130v 电压下,1×TAE液中电泳15-20min,在紫外成像仪下观察结果。
【结果判定】
在372b左右位置出现扩增带,核酸检测为阳性(如图)。
在372b左右位置未出现扩增带,核酸检测为阴性 。
【注意事项】
1.B盒使用之前请完全溶解并离心数秒后使用,蛋白酶K开盖使用后建议保存于2-8℃。
2 反复冻融试剂将降低检测灵敏度,尽量减少反复冻融。
3 为避免样本间的交叉污染,模板最后加,加模板时先加阴性对照,再加检测样品,最后加阳性对照,有条件的实验室加模板的移液器应与加其它组份的移液器分开。
4 上机前注意检查确保反应混合液内无气泡,且反应管盖紧。
【生产企业】
企业名称:山东绿都生物科技有限公司
生产地址:山东省滨州市经济开发区黄河二路169号绿都生物工程高科技园
电 话:18266598399
【有效期】本制品有效期为1年,生产日期见包装内侧。